Sự nghi ngờ nhanh chóng bị đổ dồn vào Bá tước Bothwell và những người ủng hộ của ông, đặc biệt là Archibald Douglas, Cha xứ Douglas, chủ nhân của đôi giày đã được tìm thấy tại hiện trường, và cả chính Nữ hoàng. Bothwell từ lâu đã bị nghi là có ý định chiếm ngai vàng, và mối quan hệ gần gũi của ông với nữ hoàng đã dẫn đến tin đồn họ đã ngoại tình với nhau. Đây được xem như là một động lực cho Bothwell sát hại Darnley, với sự giúp đỡ từ một số các quý tộc và dường như bởi chính hoàng gia. Mary đã được xem là chấp thuận kế hoạch loại bỏ Darnley, mặc dù ý định ban đầu của bà đã ly hôn, nhưng không ai coi đó là thích hợp.

Chẳng bao lâu sau cái chết của Darnley, Bothwell và Mary rời Edinburgh cùng với nhau. Có hai cách nhìn thường thấy về sự kiện này: có thể, Bothwell bắt cóc Nữ hoàng, đưa bà đến Lâu đài Dunbar, và cưỡng hiếp bà. Trong khi luồng ý kiến thứ hai cho rằng, Nữ hoàng đã cùng Bothwell lập kế hoạch dàn cảnh bắt cóc, và câu chuyện về cưỡng hiếp được ngụy tạo ra để danh dự và uy tín của nữ hoàng không bị hủy hoại khi bà kết hôn với một người đàn ông bị nghi ngờ là đã giết chồng mình. Mary sau đó bị sảy thai cặp song sinh con của Bothwell.

Sự nghi ngờ rằng Nữ hoàng đã cấu kết với kẻ chủ mưu trong cái chết của chồng hay bà đã không có hành động để ngăn chặn cái chết của ông là những nhân tố quan trọng dẫn đến việc Mary mất lòng dân và mất vương miện ở Scotland. Lá thư Casket, bị cáo buộc đã được viết bởi Mary, dường như thể hiện thái độ ủng hộ với sự giết chóc. Bức thư đã được phát hiện thấy bởi James Douglas, Bá tước thứ 4 Morton ở Edinburgh trong một chiếc hộp bằng bạc được khắc một chữ F (được cho là chỉ Francis II), cùng với một số tài liệu khác, bao gồm giấy chứng nhận kết hôn Mary-Bothwell.[29] Trước khi Morton bị hành quyết vào năm 1581, ông thừa nhận có tham dự vào âm mưu giết Darnley, và rằng Bothwell và Archibald Douglas là "chủ mưu chính" trong vụ giết hoàng phu.[30]

Lính đánh thuê của Bothwell, William Blackadder của Clan Blackadder, là được cho là người không tham gia vào vụ giết người, nhưng ban đầu đã bị đối xử như nghi phạm. Mặc dù đã được chứng minh là không có dính líu trong âm mưu giết người, ông ta lại bị cáo buộc bởi những âm mưu trong triều đình và bị kết án tại phiên tòa nhằm mục đích chính trị, sau đó ông ta bị hành quyết bằng cách treo cổ, kéo lê và phanh thây, các chi bị đóng đinh rồi đem mỗi bộ phận đi thị chúng trước cổng các thành phố ở Scotland.

Không lâu sau đó, cả Mary và Bothwell bị buộc tội giết Henry. Họ đã được đưa ra điều tra riêng biệt ở Anh. Bothwell đã được chứng minh là không có tội. Cuộc điều tra đối với Nữ hoàng diễn ra khá lâu, kết thúc mà không tìm được kết luận chính thức. Mary đã bị giam lỏng ở Anh cho đến khi bị cáo buộc có dính líu trong âm mưu Babington nhằm lật đổ Elizabeth, sau đó bà đã bị kết tội phản quốc và bị chém đầu.[31]